Kromatografi Nedir ve Hangi Alanlarda Kullanılır? Farklı Kromatografi Teknikleri Nelerdir

1) подготовка анализируемой пробы, выбор соответствующей неподвижной и подвижной фазы, подготовка сорбента (колонки или тонкого слоя);

Общая характеристика хроматографического метода анализа.

Основы хроматографического метода анализа были разработаны русским ученым М.С. Цветом в 1903 г. В своей опубликованной работе он описал разделение зеленого пигмента растений на составляющие его компоненты путем пропускания экстракта из листьев через стеклянную трубку, заполненную порошком мела. При этом на белом адсорбенте наблюдалось образование нескольких зон различной окраски.

Вследствие этого М.С. Цвет предложил открытый им метод разделения смесей назвать хроматографией (от греческого слова «хроматос» – цвет).

Цвет Михаил Семёнович (1872 – 1919). Замечательный русский ботаник Михаил Семёнович Цвет известен своими исследованиями хлорофилла. Он является творцом нового метода анализа вещества – адсорбционного метода хроматографического анализа, открывшего широчайшие возможности для тонкого химического исследования. В силу исторической случайности адсорбционный метод хроматографического анализа, полностью разработанный М.С. Цветом и успешно им применённый практически, был в забвении почти 30 лет. Лишь начиная примерно с 1931 г., метод М.С. Цвета стал находить всё более и более растущее применение во многих областях науки.

Неподвижной, или стационарной, фазой в хроматографических методах анализа обычно служит твердое тело или жидкость (чаще всего в виде тонкой пленки, нанесенной на поверхность твердого вещества). Данная фаза выступает в роли адсорбента.

Подвижная фаза, или элюент, представляет собой жидкость или газ, пропускаемые в ходе анализа через неподвижную фазу. Она растворяет в себе компоненты исследуемой смеси и переносит их вместе с собой по мере своего продвижения.

Неподвижную фазу обычно помещают в стеклянную или металлическую трубку, называемую хроматографической колонкой. При прохождении через нее подвижной фазы вместе с растворенной смесью веществ на активных центрах адсорбента происходят многократно повторяющиеся акты сорбции и десорбции отдельных компонентов смеси.

При этом вследствие различной адсорбционной способности вещества смеси будут перемещаться вдоль неподвижной фазы с разной скоростью. В результате чего произойдет их разделение на зоны, каждая из которых содержит преимущественно одно из соединений смеси.

Быстрее всего станет двигаться то вещество смеси, которое обладает наименьшим сорбционным сродством по отношению к неподвижной фазе. Вещество, обладающее наибольшим сорбционным сродством, наоборот, будет перемещаться медленнее всего и будет отставать от других компонентов смеси (рис. 126).

Рис. 126. Хроматографическое разделение. Скорость перемещения компонентов исходной смеси увеличивается в порядке В < А < С

Чем больший путь относительно неподвижной фазы пройдет анализируемая смесь и чем сильнее ее компоненты различаются своей адсорбционной способностью друг от друга, тем более полным и глубоким будет их разделение.

При дальнейшем пропускании чистого элюента образовавшиеся зоны индивидуальных веществ будут двигаться по слою адсорбента вследствие непрерывно идущего процесса адсорбции – десорбции, и подхваченные током жидкости или газа, выйдут с элюентом из колонки в определенной последовательности: первым – наиболее слабо сорбирующееся соединение, последним – наиболее сильно сорбирующееся.

На выходе из колонки компоненты смеси фиксируют с помощью автоматических детекторов (в газовой и жидкостной хроматографии) либо путем отбора фракций выходящего раствора и анализом их методами спектрофотометрии, рефрактометрии и т.д.).

Кроме колоночной, существует плоскостная хроматография. Она подразделяется на бумажную и тонкослойную.

В бумажной хроматографии в качестве неподвижной фазы используются полоски специальной хроматографической бумаги, полученной из чистой целлюлозы. В некоторых случаях на нее наносится жидкая пленка полярного растворителя, например, воды.

При использовании метода тонкослойной хроматографии (ТСХ) неподвижную твердую либо жидкую фазу тонким слоем наносят на пластинку-носитель, выполненную из стекла, металлической фольги или полимерной пленки.

Классификация хроматографических
методов анализа

Хроматографические методы анализа классифицируются самым различным образом. Как было показано ранее, в зависимости от применяемой техники эксперимента различают колоночную и плоскостную хроматографии.

В зависимости от агрегатного состояния подвижной фазы различают газовую и жидкостную хроматографии.

Газовую хроматографию применяют для разделения объектов, представляющих смесь газов либо паров, не взаимодействующих друг с другом и устойчивых к разложению в условиях анализа (особенно при повышенной температуре).

В зависимости от агрегатного состояния неподвижной фазы выделяют газожидкостную и газотвердофазную хроматографию. В качестве подвижной фазы (газа-носителя) во всех случаях, как правило, используется инертный газ, не способный реагировать с компонентами смеси. Чаще всего в его роли выступают гелий, азот или аргон, значительно реже – водород и углекислый газ.

Жидкостная хроматография используется для анализа и разделения обладающих большой молекулярной массой нелетучих веществ или легкоразложимых соединений, которые нельзя перевести в парообразное состояние. С ее помощью выделяют макромолекулы биополимеров, аминокислоты, моно-, ди- и олигосахариды и др. вещества.

В зависимости от агрегатного состояния неподвижной фазы выделяют жидкостно-жидкостную, жидкостно-твердофазную и жидкостно-гелевую хроматографии. В последнем случае неподвижной фазой является гель.

По доминирующему механизму взаимодействия веществ разделяемой смеси с неподвижной фазой различают адсорбционную, распределительную, ионообменную, хемосорбционную, молекулярно-ситовую и др. хроматографии.

Адсорбционная хроматография основана на различной способности отдельных компонентов смеси вступать во взаимодействие с поверхностью адсорбента и удерживаться на его активных центрах. Компоненты, имеющие большое сродство к адсорбенту, медленнее передвигаются вдоль стационарной фазы, чем компоненты, имеющие малое сродство. Они находятся в неподвижной фазе более длительный отрезок времени.

Вещества, не адсорбирующиеся или плохо адсорбирующиеся неподвижной фазой, находятся преимущественно в подвижной фазе. Скорость их перемещения относительно поверхности адсорбента будет наибольшей.

Распределительная хроматография основана на разнице коэффициентов распределения веществ в анализируемой смеси между двумя фазами. Причем неподвижной фазой в данном случае может быть только жидкость, а подвижной – тоже жидкость или (в некоторых случаях) газ:

где K – коэффициент распределения (безразмерная величина); С_ПФ – концентрация компонента анализируемой смеси в подвижной фазе; С_НФ – концентрация того же компонента в неподвижной фа зе.

Таким образом, в основе данного метода лежит закон распределения Нернста (см. раздел «Учение о растворах»).

Вещество, более растворимое в неподвижной фазе, находится в ней большую часть времени. Скорость передвижения его относительно невелика. Менее растворимые вещества передвигаются быстрее, т.к. в неподвижной фазе они находятся меньшую часть времени. Чем больше разница в значениях коэффициентов распределения K для веществ, входящих в состав смеси, тем полнее будет происходить их разделение.

Ионообменная хроматография основана на обратимом обмене ионов, содержащихся в исследуемой смеси, на подвижные ионы, входящие в состав ионита. Разделение веществ связано с различием в величинах констант ионного обмена определяемых ионов.

Хемосорбционная хроматография включает в себя несколько вариантов хроматографических процессов, общим для которых является протекание какой-либо химической реакции. Разделение веществ связано с их различной способностью вступать в те или иные реакции.

Примером хемосорбционной хроматографии является биоспецифическая (аффинная) хроматография, широко применяемая в биохимических исследованиях. Она основана на специфичности взаимодействия ферментов.

Стационарная фаза содержит в своем составе либо фермент, либо его субстрат. В первом случае она избирательно удерживает соответствующий субстрат (группу субстратов), во втором случае – фермент (группу ферментов). Отличительной чертой аффинной хроматографии является высокая избирательность процесса, повторяющего или имитирующего реакции, происходящие в реальных живых системах.

Молекулярно-ситовая хроматография (устаревшее название – гель-фильтрация) позволяет анализировать смеси, содержащие высокомолекулярные соединения (биополимеры), разделять их на фракции, различающиеся размерами и массой молекул.

В качестве неподвижной фазы используют гелеобразные пористые тела (так называемые молекулярные сита), образованные гибкими линейными макромолекулами полимеров, сшитыми поперечными связями.

Сетчатое трехмерное строение геля способствует его набуханию в воде. Набухший гель имеет развитую пористую структуру. Причем содержащиеся в нем поры отличаются друг от друга по диаметру.

Пористые частицы или гранулы геля проницаемы для молекул только определенного размера. Крупные молекулы, не попадая в поры геля, перемещаются вдоль его гранул быстрее, чем мелкие, и первыми выходят из хроматографической колонки. Самые маленькие молекулы, способные проникать в поры всех размеров, выходят из колонки последними.

Методика разделения и идентификации
компонентов смеси

Хроматографическая методика состоит из следующих основных этапов:

1) подготовка анализируемой пробы, выбор соответствующей неподвижной и подвижной фазы, подготовка сорбента (колонки или тонкого слоя);

2) нанесение пробы на тонкий слой сорбента или ввод ее в разделительную колонку;

3) собственно хроматографирование, т.е. передвижение вместе с подвижной фазой относительно неподвижной фазы;

4) обнаружение зон разделенных веществ, т.е. их детектирование и идентификация;

5) количественное определение веществ в разделенных зонах.

Общая схема колоночного хроматографа приведена на рис. 127.

Важнейшей частью такого прибора, кроме разделительной колонки, является детектор. Это прибор непрерывного действия, создающий аналитический сигнал (например, электрический ток) на соединения, присутствующие в подвижной фазе, выходящей из колонки (элюате). Подвижная фаза, вводимая в колонку, называется элюентом.

Рис. 127. Принципиальная схема колоночного хроматографа:
1 – устройство для ввода пробы в хроматографическую колонку (дозатор); 2 – хроматографическая колонка; 3– детектор (анализирующая система); 4 – регистратор

Аналитический сигнал, создаваемый детектором, преобразуется с помощью самописца в так называемую внешнюю хроматограмму, графически показывающую зависимость интенсивности сигнала от времени. Если скорости перемещения компонентов достаточно различаются, то на выходе из колонки сначала появляется наименее сорбируемый компонент, затем следующий и т.д. В результате хроматограмма состоит из нескольких пиков, имеющих форму гауссовой кривой (рис. 128).

Понравилась статья? Добавь ее в закладку (CTRL+D) и не забудь поделиться с друзьями:

Kromatografi Nedir ve Hangi Alanlarda Kullanılır? Farklı Kromatografi Teknikleri Nelerdir?

Bu türev bir içeriktir. Yani bu yazının omurgası, Bioanalysis Zone isimli kaynaktan çevrilerek dilimize uyarlanmıştır; ancak “çeviri” içeriklerimizden farklı olarak, bu içerikte orijinal metin birebir korunmamıştır. Anlatım ve konu akışı gibi detaylar Evrim Ağacı yazar(lar)ı ve/veya editörler tarafından güncellenmiş, değiştirilmiş ve/veya geliştirilmiştir. Yazar, kaynaktan alınan metin omurgası üzerine kendi örneklerini, bilgilerini, detaylarını eklemiş; içeriği ve anlatımı zenginleştirmiş ve/veya çeşitlendirmiş olabilir. Bu ek kısımlarla ilgili kaynaklar da, yazının sonunda gösterilmiştir. Metnin omurgasını oluşturan kaynağı, orijinal dilinde okumak için lütfen yukarıdaki bağlantıya tıklayınız. Bu içerik, diğer tüm içeriklerimiz gibi, İçerik Kullanım İzinleri’ne tabidir.

Bilimi Anlatmamıza Yardım Edin!

Her ay milyonlarca bilimsever, Evrim Ağacı olarak karmaşık bilimsel konuları basitçe anlatmamızdan ve ülkemizde bilim anlatıcılığını geliştirmeye yönelik yaptığımız kapsamlı çalışmalarımızdan faydalanıyor. Bütçenize zarar vermeden, aylık veya tek seferlik sadece 20₺ gibi miktarlarda bize destek olarak bu çabalarımızı destekleyebilir, Türkiye’de bilim okuryazarlığını güçlendirmemize katkı sağlayabilirsiniz.

Neden Destek İstiyoruz? | Zaten Destekçiyim
Bioanalysis Zone
Yasemin Akın
Çağrı Mert Bakırcı

Kromatografi, karışımları bileşenlerine ayırmak için basit veya karmaşık yöntemlerle laboratuvarda gerçekleştirilen bir tekniktir. Kağıt kromatografisi ve ince tabaka kromatografisinden, gaz kromatografisine kadar birçok farklı kromatografi türü vardır.

Kromatografi, ayrıştırılmak istenen bileşenin sabit bir faza eklenmesi ve bu sabit faz üzerinde akan bir başka hareketli faz sayesinde bileşenlerine ayrılması ilkesine dayanır. Bu ayırma işlemi üzerinde etkili olan faktörler; adsorbsiyon, katı ve sıvı fazlaların özellikleri, bileşenlerin moleküler ağırlık ları ve afinitelerindeki farklılıklardır. Bu farklılıklar nedeniyle kromatografide çalışılan karışımın bazı bileşenleri fazlar içinde daha yavaş, bazıları daha hızlı hareket eder. Bu sayede karışımın bileşenleri birbirinden ayrılmış olur.

Bir kromatografi sistemini oluşturan temelde sabit faz, hareketli faz ve ayrıştırılmak istenen karışım olmak üzere 3 bileşen vardır. Ayrıştırılmak istenen karşımım haricindeki iki bileşeni yakından tanı yalım:

Hareketli faz: Pek çok kromatografi tekniği olmasına rağmen, temelde hepsi aynı prensipte çalışır. Tüm farklı türlerde sabit faz ve hareketli faz bulunur ve bunlar türden türe farklılık gösterir. Hareketli faz, içerisinde ayrıştırılmak istenen karışım ile birlikte sabit olan diğer faz üzerinde hareket eder. Hareketli faz sıvı veya gaz olabilir. Hareketli faz bir sıvı ise teknik sıvı kromatografisi, hareketli faz bir gaz ise teknik gaz kromatografisi olarak anılır. Hareketli faz genelde bir tampon çözelti olarak hazırlanır ve ayrıştırılmak istenen karışımı çözen bir çözücü görevi görür.
Sabit faz: Kromatografide sabit faz, bir katı veya katı üzerine tutturulmuş bir sıvı fazdır. Genellikle katı sabit fazlar silika ya da alümina gibi gözenekli maddelerdir. Sabit fazın yapısı kullanılan kromatografiye göre değişir. Örneğin ince katman kromatografilerinde, sabit faz olarak önce aliminyum levhalar üzerine paketlenmiş silika jelin kullanılması yaygındır. Bir kolon sisteminin kullanıldığı kromatografi türlerinde, sabit faz genelde cam bir borunun içerisine sabitlenir. Karışımın içerdiği sabit faz, hareketli faz ve maddeler arasındaki etkileşim türü, moleküllerin birbirinden ayrılmasında etkili olan temel bileşendir. Yaygın bir sabit faz olan silika, yüzeyinde Si-O-H bağları içerir. Si-O bağları ve hidroksil grupları, silika jel yüzeyinin çok kutuplu olduğu, hidrojen bağları oluşturabildiği ve ayrıca Van der Waals, dipol-dipol ve indüklenmiş dipol-dipol etkileşim lerinde de yer alabileceği anlamına gelir.

Bir ayırma yöntemi olarak kromatografinin kristalleştirme, çözücü ekstraksiyonu ve damıtma gibi diğer eski tekniklere göre çok sayıda avantajı vardır. Çok bileşenli bir karışım, mevcut maddelerin kimliği, sayısı veya göreceli miktarı bilinmese bile ayrıştırılabilir. Kromatografi büyük boyuttaki bir virüs ten, atomların en küçüğü olan hidrojene kadar çok çeşitli maddeleri ayrıştırabilmesi açısından çok yönlü bir tekniktir.

Creutzfeldt Jakob Hastalığı Nedir? Belirtileri ve Nedenleri Nelerdir?
Aşı Kimyası: Aşıların İçinde Ne Var? Aşıların Güvenliğini ve Ne Süreyle Korunacağını Etkileyen Faktörler Nelerdir?
Hem HIV, Hem Ebola Virüslerinin Hücreden Ayrılmasını Engelleyen Proteinler Keşfedildi!

Kromatografinin Tarihi

Kromatografinin en ilkel uygulamaları, ipleri, kumaşları veya filtre kağıdını boyamak için çalışan boya kimyagerleri tarafından gözlemlenmiştir. Bilim insanları boyaya batırılan malzemenin üzerinde, boya çözeltisinin kılcal koşullara bağlı kalarak hareket ederek farklı renklere ayrıştığını gördüler.

19. yüzyılda birkaç Alman kimyager, bu olayı incelemek için birkaç kasıtlı deney yaptılar. Bu deneylerde inorganik bileşik çözeltileri bir parça filtre kağıdının üzerine bırakılarak eş merkezli renkli halkaların oluşması sağlandı. 1861’de Friedrich Goppelsröder, bu yöntemi açıklayan kılcal analiz adında bir inceleme yayınladı.

Bununla birlikte kromatografinin keşfi, genellikle Mikhail S. Tsvet ile ilişkilendirilir. Tsvet karotenoidler ve klorofil lerle yaptığı çalışmaları sonucunda bugün temelde aynı biçimde kullanılan bir tekniği tanımladı. Bu teknikte Tsvet, bir cam kolona alümina, silika veya pudra şekeri gibi adsorbe edici bir madde paketledi. Ardından bitki pigmentlerini içeren çözeltiyi kolona ekledi. Son olarak kolonu organ ik bir çözücü ile yıkadı ve pigmentlerin farklı renklerde bantlar oluşturarak kolonda ayrıştığını fark etti. Tsvek bu yönteme, Yunancada “renkli yazma” anlamına gelen kromatografi ismini verdi. Yine de bu yöntem 1931’de Alman kimyager Edgar Lederer‘in, kromatografi yönteminin biyolojik ürünleri ayırmak için iyi bir teknik olabileceğini bildirmesine kadar fark edilmedi.

Evrim Ağacı’ndan Mesaj

Aslında maddi destek istememizin nedeni çok basit: Çünkü Evrim Ağacı, bizim tek mesleğimiz, tek gelir kaynağımız. Birçoklarının aksine bizler, sosyal medyada gördüğünüz makale ve videolarımızı hobi olarak, mesleğimizden arta kalan zamanlarda yapmıyoruz. Dolayısıyla bu işi sürdürebilmek için gelir elde etmemiz gerekiyor. Bunda elbette ki hiçbir sakınca yok; kimin, ne şartlar altında yayın yapmayı seçtiği büyük oranda bir tercih meselesi. Ne var ki biz, eğer ana mesleklerimizi icra edecek olursak . Daha fazla göster

Bunda elbette ki hiçbir sakınca yok; kimin, ne şartlar altında yayın yapmayı seçtiği büyük oranda bir tercih meselesi. Ne var ki biz, eğer ana mesleklerimizi icra edecek olursak (yani kendi mesleğimiz doğrultusunda bir iş sahibi olursak) Evrim Ağacı’na zaman ayıramayacağımızı, ayakta tutamayacağımızı biliyoruz. Çünkü az sonra detaylarını vereceğimiz üzere, Evrim Ağacı sosyal medyada denk geldiğiniz makale ve videolardan çok daha büyük, kapsamlı ve aşırı zaman alan bir bilim platformu projesi. Bu nedenle bizler, meslek olarak Evrim Ağacı’nı seçtik.

Eğer hem Evrim Ağacı’ndan hayatımızı idame ettirecek, mesleklerimizi bırakmayı en azından kısmen meşrulaştıracak ve mantıklı kılacak kadar bir gelir kaynağı elde edemezsek, mecburen Evrim Ağacı’nı bırakıp, kendi mesleklerimize döneceğiz. Ama bunu istemiyoruz ve bu nedenle didiniyoruz.

1950’li yıllarda bir bilim insanının kolon kromatografisi çalışması Wikipedia

Kromatografi Nasıl Çalışır?

Tüm farklı kromatografi teknikleri temelde aynı prensiplere dayanır. Adlarından da anlaşıldığı üzere hareketli faz akıcı, sabit faz ise hareketsizdir. Hareketli faz karışımı sabit faz boyunca taşıdığından, karışımdaki bileşenler bu taşıma işlemi sırasında farklı bölümlere ayrılır.

Ayrışmanın temelinde karışımdaki bileşenlerin sabit ve hareketli fazlarla olan etkileşimlerindeki farklılıklar yatar. Pratikte bu durum, kromatografideki sabit faza daha sıkı tutunan moleküllerin sabit fazda daha uzun süre kalması veya yavaş hareket etmesi, bunun yanında sabit faza sıkı sıkıya tutunamayan moleküllerin diğer bileşenlerden ayrılarak daha hızlı hareket etmesi ile sonuçlanır. Bu şekilde ayırma tekniği, kromatografinin temelidir.

Saf olmayan karışım kolondan geçerken, karışımın bileşenlerinin ne kadar ayrıştırılabildiği iki özelliğe bağlı olacaktır;

Her bir bileşiğin sabit faza tutunma derecesi: Bu bileşenler ve sabit fazda kullanılan maddenin arasındaki etkileşime bağlıdır.
Her bir bileşenin hareketli fazda ne kadar çözünür olduğu: Bu bileşenler ve hareketli fazın hazırlanmasında kullanılan çözücülerin etkileşimine bağlıdır.

Örneğin basit bir sıvı kolon kromatografisi sisteminde, bir cam kolonun altına cam yünü veya sintirlenmiş cam hamuru yerleştirilir. Sütun daha sonra silika ile doldurulur. Kuru paketleme ya da silis bulamacı adı verilen çeşitli paketleme tipleri vardır. Sabit fazın hazırlanmasında önemli olan faktör, hareketli faz akışını engelleme olasılığına karşın, silikanın hava kabarcıkları veya çatlaklar olmadan iyi bir şekilde paketlenmesini sağlamaktır. Silika şeklindeki sabit faz iyice paketlendikten sonra, genellikle elüent olarak adlandırılan hareketli faz, silika kolonunun tepesine ulaşacak kadar cam kolona eklenir. Daha sonra ayrıştırılacak karışım, silika ve elüentten oluşan kolona dikkatli bir şekilde, azar azar eklenir. Bir çözücü ya da çözücüler karışımı olabilen elüent, daha sonra karışımın tamamı sistemi terk edene kadar yavaş yavaş sisteme eklenir.

Elüent kolondan aşağı doğru aktığında, karışımın bu durumda silika olarak kullanılan sabit faza sıkıca tutunan bileşenleri kolonda daha uzun kalacaktır. Tersine, sabit faza tutunamayan bileşenler hızlı bir şekilde kolondan yıkanacaktır ve aşamalı olarak toplanabilecektir. Bu işlem tek tek tüm bileşenler kolondan ayrıştırılana kadar devam eder. Sonuç olarak başlangıçta bir bütün olan karışım, bileşenlerine ayrılır.

Karşımdaki birkaç bileşen çok benzer özelliklere sahip olabilir. Karmaşık kromatigrafik ayrılmalarda çok sayıda bileşenin aynı anda kolondan çıkması anlamına gelen elüsyon meydana gelebilir. Hareketli fazın dikkatli ve kapsamlı bir şekilde değiştirilmesi, farklı çözücü sistemlerinin denenmesi, ve pH’ın değiştirilmesi yoluyla, en karmaşık bileşenler bile basit kromatografi teknikleriyle saflaştırılabilir.

Bölmeye dayalı kromatografi yöntemleri, amino asit ler, karbonhidratlar ve yağ asitleri gibi küçük moleküllerin ayrıştırılmasında oldukça etkilidir. Bununla birlikte, iyon değişim kromatografisi gibi afinite kromatografileri, nükleik asit ler ve protein ler gibi makromoleküllerin ayrıştırılmasında daha etkilidir. Kağıt kromatografisi protein lerin ayrıştırılmasında ve protein sentezi ile ilgili araştırmalarda kullanılır. Gazlı sıvı kromatografileri alkol, lipit, eter, amino grupları gibi maddelerin ayrıştırılmasında ve enzim atik etkileşimlerinin gözlenmesinde kullanılırken boyut dışlama kromatografisi özellikle protein lerin moleküler ağırlıklarının belirlenmesinde kullanılır. Agaroz jel kromatografisi RNA , DNA ve virüslerin saflaştırılmasında kullanılır.

Kromatografinin Kullanım Alanları

Daha önce de değindiğimiz gibi, kromatografi bir ayırma tekniğidir ve bu nedenle uygulama alanları geniş ve çeşitlidir. Birçok bilim insanı, birçok projede bir noktada kendilerini bir tür kromatografi çalışması yaparken bulacaktır. Kromatografi, istenen rekasiyon ürününü saf olmayan bir karışımdan izole etmek için de kullanılabilir.

Kromatografi ayrıca analitik bir teknik olarak da kullanılır. Bir karışımı tek tek bileşenlerine ayırarak bir numunedeki maddeleri izole edebilir ve daha sonra bunları daha ileri analizlere tutabilirsiniz. Bazı kromatografi biçimleri, attogram (10-18 gram) düzeyinde bulunan maddeleri saptayabilir ve bu da kromatografiyi başarılı bir iz arama tekniği yapar.

Kromatografi iyi bir ayrıştırma tekniği olmasının sonucunda petrol endüstrisinde de kendine uygulama alanı bulur. Bu endüstride, petroldeki karmaşık hidrokarbon karışımlarını analiz etmek için kullanılır. Biyoanalitik alanda, kromatografi kimyasal bileşiklerin ve terapötik ilaçların ayrılması ve tanımlanma sı için yaygın olarak kullanılmaktadır.

Kromatografi tekniği, biyokimyacılar için değerli bir araçtır ve klin ik laboratuvarlarda yapılan çalışmalarda kolaylıkla uygulanabilmektedir. Örneğin, kağıt kromatografisi, kalıtsal metabolik bozukluklarla ilişkili vücut sıvılarındaki bazı şeker türlerini ve amino asitleri belirlemek için kullanılmaktadır. Gaz kromatografisi laboratuvarlarda steroidleri, barbitüratları, ve lipidleri ölçmek için kullanılır. Vitamin ve proteinlerin ayrıştırılmasında da kromatografik teknikler kullanılmaktadır.

Kromatografi Türleri

Kullanılan sabit ve hareketli fazların özelliklerine, tekniğin verimliliğine ve incelenen maddelere göre farklılık gösteren birçok kromatografi türü vardır.

Kolon Kromatografisi

Makromoleküller boyut, şekil, net yük, kullanılan sabit faza bağlanma derecesi gibi çok farklı karakteristik özelliklere sahip olduklarından, bu karakteristik özelliklerin her biri kromatografik yöntemlerin kullanılmasında temel oluşturabilir. Bu yöntemler arasında en sık kolon kromatografisi uygulanır. Bu teknik, biyom oleküllerin saflaştırılması için sıkça kullanılır. İçerisine sabit faz tutturulmuş, genelde cam olan kolon üzerine önce ayrıştırılmak istenen numune, ardından yıkama tamponu olarak kullanılan hareketli faz eklenir. Fiberglas bir destek üzerine yerleştirilen kolon malzemesi içerisinden akış sağlanır. Numuneler, zamana ve hacme dayalı olarak kolonun altında toplanır.

Agora Bilim Pazarı

Haydi, muhteşem bir yolculuğa çıkalım,
gökyüzünde parlayan GEZEGENLERLE tanışalım.
Madem oralar arabayla gidemeyecek kadar uzak, biz de ROKETE atladığımız gibi uçarız, çabucak!

Çok satan çocuk kitaplarının ödüllü yazarı Caryl Hart’tan, kafiyeli anlatımı ve göz alıcı çizimleriyle, geleceğin ASTRONOTLARI için MUHTEŞEM bir resimli kitap!

Serinin diğer kitabı Bak Şu Okyanusa‘yı incelemek için buraya tıklayabilirsiniz.

Devamını Göster

Kolon kromatografisinin bu örneğinde, cam kolonun altındaki yarı saydam kısım, kolona tutturulmuş sabit silika jel fazını, renki sıvı numuneyi, kolonun üstündeki şeffaf kısım ise hareketli faz olan çözeltiyi göstermektedir. News Medical

İyon Değişim Kromatografisi

İyon değişim kromatografisi, yüklü makromoleküler grupları ve katı bir destek malzemesi olan matris arasındaki elektrostatik etkileşimlere dayanır. Matris, ayrıştırılacak makromoleküllere zıt olan bir elektrik yüküne sahiptir. Bu şekilde proteinin kolona olan afinitesi iyonik bağlarla sağlanır. Proteinler kolondan pH, iyon tuzlarının konsantrasyonu veya tampon çözeltinin iyonik kuvveti değiştirilerek ayrılır. Pozitif yüklü iyon değişim matrislerine anyon değişim matrisleri denir ve bunlar negatif yüklü proteinleri adsorbe eder. Negatif gruplarla bağlı matrisler, katyon değişim matrisleri olarak bilinir ve pozitif yüklü proteinleri adsorbe eder.

Boyut Dışlama Kromatografisi

Bu yöntemin temel prensibi, makromolekülleri moleküler boyutlarındaki farklılıklara göre ayırmak için dekstran içeren malzemeler kullanmaktır. Bu prosedür genel olarak proteinlerin moleküler ağırlıklarının belirlemek ve protein çözeltilerinin tuz konsantrasyon larını azaltmak için kullanılır. Kolondaki sabit faz, küçük gözenekli ve reaksiyona girme eğilimi olmayan moleküllerden oluşur. Farklı boyutlarda moleküller içeren çözelti, kolonu sabit bir akış hızı ile geçer. Gözeneklerin boyutundan daha büyük olan moleküller gözeneklere girip jel partikül lerine nüfus edemezler. Bu nedenle kolon içerisinden hızla akarlar. Gözeneklere girebilecek moleküller ise kolon içinde dolaşır ve yavaşlatılırlar. Moleküller küçüldükçe kolonda tutulma süreleri artar bu nedenle en küçük moleküller kolonu en son terk ederler. Sephadeks G tipi en çok kullanılan kolon malzemesidir. Ayrıca dekstran, agaroz, poliakrilamid de kolon malzemesi olarak kullanılır.

Afinite Kromatografisi

Afinite kromatografisi tekniği, enzimlerin, hormon ların, antikor ların, nükleik asitlerin ve spesifik proteinlerin saflaştırılması için kullanılır. Afinite kavramı iki maddenin birbirine olan bağlanma ilgisini ifade eder. Spesifik protein ile bir kompleks oluşturabilen bir ligand, kolonun dolgu malzemesine bağlanır. Örneğin saflaştırılmak istenen bir enzim ise, kolona enzimin substrat ı dahil edilir. Bir antikor saflaştırılacaksa antikor a özgü bir antijen kolona dahil edilir. Ligand ile kompleks oluşturabilen protein kolona bağlı kalırken, kompleks oluşturamayanlar kolondan ayrılır. Daha sonra kolona bağlı olan protein pH ya da tuz konsantrasyonunun değiştirilmesi ile kolondan ayrılır.

Afinite kromatografisi Lehninger Biyokimyanın İlkeleri 3. Baskı

Düzlemsel Kromatografi

Düzlemsel kromatografide, sabit faz silindirik bir kolona paketlenmenin yerine, bir düzlem olarak bulunur. Bu düzlem içerisinde gözenekler olan bir kağıt ya da üzerine katı partiküller tutturulmuş ince bir cam ya da metal tabaka olabilir. Karşımdaki farklı bileşenler çözülme özelliklerine göre düzlemde farklı uzaklıklar kat ederler.

Kağıt Kromatografisi

Kağıt kromatografisinde bir filtre kağıdının ucuna bir miktar numune eklenir. Numune sığ bir çözücü içeren kaba, zemine dik bir şekilde yerleştirilir ve kağıdın yalnızca bir kenarının doğrudan çözücü ile temas ettiğinden emin olunur. Çözücü kılcal hareketle kağıt boyunca yükselir. Bu sırada numunedeki bileşenleri de çözer ve kendisi ile birlikte hareket ettirir. Kullanılan kağıt, gözenekli selüloz tabakadır ve selüloza bağlanan polar moleküller daha yavaş hareket ederken, polar olmayan moleküller daha hızlı hareket eder.

İnce Tabaka Kromatografisi (TLC)

İnce tabaka kromatografisi farklı biyokimyasalları sabit ve hareketli faza olan duyarlılıklarına göre ayıran, laboratuvarlarda sıkça kullanılan bir tekniktir. Bu yöntem kağıt kromatografisine oldukça benzerdir. Bununla birlikte, sabit faz olarak kağıt kullanmak yerine düz inert bir tabaka üzerine silika jel veya alümina gibi adsorban bir madde tutturulmuştur. TLC’de aynı katman üzerinde aynı anda birden fazla numune ayrıştırılabilir. TLC ilaç dozlarını ve su saflığını test etmek için oldukça kullanışlıdır. Kağıt kromatografisi ile karşılaştırıldığında, daha hızlı çalışma, daha iyi ayrıştırma, daha niceliksel analizler sunma ve adsorbanlar arasında seçim yapma avantajları vardır.

Numunenin bileşenlerinin renksiz olduğu durumlarda, kromatogramdaki görüntülerini belirlemek için görünür reaktif bir ürün elde etmek adına floresan boyalar, radyoaktivite veya belirli bir kimyasal madde kullanılabilir. Bu sayede görünür ışık veya UV ışığı altında görünür bir renk oluşturulabilir. Karşımdaki moleküllerin konumu, her bir molekülün kat ettiği mesafenin oransal ifadesi ile elde edilir. Bu ölçüm değerine göreceli hareketlilik denir ve R_f olarak ifade edilir. R_f değeri moleküllerin kalitatif tanımlanması için kullanılır.

TLC tekniği ile pigmentlerine ayrıştırılmış bir boya örneği Wikipedia

Gaz Kromatografisi

Bu yöntemde sabit faz, sisteme yerleştirilmiş bir inert katının yüzeyine adsorbe edilmiş bir sabit sıvı fazdır. Gaz kromatografisi bir gaz-sıvı kromatografisidir. Hareketli faz helyum veya nitrojen gibi gazlardan oluşur. İnert bir gaz olan hareketli faz, yüksek basınç altında bir kolondan geçirilir. Analiz edilecek numune buharlaştırılır ve hareketli gaz faza dahil edilir. Numunede bulunan bileşenler, katı destek üzerindeki sabit sıvı fazda dağılır. Gaz kromatografisi çok küçük boyutlardaki moleküllerin yüksek verimlilikte birbirlerinden ayrıştırılmasında kullanılan, son derece basit, çok yönlü, hassas ve hızlı bir tekniktir. Çok az miktarlardaki numunenin ayrıştırılması için kullanılabilir.

Ters-Faz Kromatografi

Ters-faz kromatografisi hareketli fazın sabit fazdan daha polar olduğu herhangi bir sıvı kromatografisi prosedürüdür. Tekniğin “ters” adını almasının sebebi, normal şartlar altında sıvı kromatografilerinde sabit fazın polar olmasıdır. Numunedeki polar olmayan bileşenler, sabit faza daha çok tutunur ve kısa mesafeler boyunca hareket eder. Bununla birlikte numunenin polar bileşenleri, polar olan hareketli faz boyunca daha uzun mesafeler boyunca hareket ederler.

Hidrodinamik Kromatografi

Hidrodinamik kromatografi tekniği, boyuta göre ayrıştırma tekniklerinden türemiştir ve uygulama alanı mikron düzeyinde küçük olan koloidal partiküllere kadar uzanır. Bir kolonda büyük koloidal partiküller kolonun çevresine yapışmaktansa orta kısmında kalırlar ve daha hızlı hareket ederler. Küçük partiküller bunun tersine, kolonun etrafına itilirler ve yavaş hareket ederek kolonu daha geç terk ederler. Bu teknik, ışıklı detektörler, viskometreler ve refraktometreler ilave edilerek kullanıldığında molekülleri molar kütleye, boyuta ve şekle göre ayırmada kullanılabilir.

HDC’nin iki tipi, “açık tüp HDC” ve “paketlenmiş kolon HDC” olarak bilinir. Açık tüp metodu küçük molar kütleye sahip molekülleri ayrıştırmak için kullanılırken paketlenmiş kolon tekniği 10 5 dalton dan büyük molekülleri ayrıştırır. HDC, diğer kromatografi türlerinden farklıdır çünkü ayrıştırma işlemi yalnızca, paketlenmiş bir kolondaki partikülleri çevreleyen ve parçacıklar arasındaki hacim olan ara bölmede gerçekleşir.

Hidrodinamik kromatografi tekniğininde büyük boyutlu parçacıklar kolonun ortasında ve daha hızlı, küçük boyutlu parçacıklar kolonun çevresinde ve yavaş hareket ederler. Sharif, Fariya & Westerhoff, Paul & Herckes, Pierre. (2013). Sorption of trace organics and engineered nanomaterials onto wetland plant material. Environmental science. Processes & impacts. 15. 267-74. 10.1039/c2em30613a.

Hidrofobik Etkileşim Kromatografisi (HIC)

Hidrofobik etkileşim kromatografisi, bir çeşit afinite kromatografisidir. Klasik afinite kromatografisinde olduğu gibi ligandın kolona bağlanması için kolon malzemesi olarak adsorbanlar kullanılır. Hidrofobik etkileşim kromatografisi tekniğinde, matrise hidrofobik özellikli yan zincirler bağlanır. Bu sayede eklenen numunedeki bileşenlerin hidrofobik etkileşimlere yakınlığına bağlı olarak bu bileşenler birbirlerinden ayrılabilir.

İki Boyutlu Kromatografi

Bir kolon kullanılarak karışımları ayrıştırmanın yeterli olmadığı durumlarda. normal tekniğe ek olarak farklı fizikokimyasal özelliklere sahip ikinci bir kromatografi eklenebilir. Bunun basit bir örneği, iki boyutlu ince tabaka kromatografisidir. Bu yöntemde karışım, tabaka boyunca yatay sütunlar şeklinde elde edildikten sonra, tabaka 90° çevrilir ve başka bir sığ çözelti kabına konulur. Bu sayede karışım sadece tek bir dikey sütundaki yatay banlar halinde değil, düzlemin birçok noktasında bileşenlerine ayrılır. İki boyutlu kromatografi yaklaşımı diğer gaz kromatografisi ve sıvı kromatografisi yöntemlerine uygulanabilir.

İki boyutlu kromatografi ile aynı mantık üzerine kurulu başka bir ayırma tekniği iki boyutlu jel elektroforezidir. Bu yöntem, binlerce farklı proteinin iki adımlı basit bir yaklaşımla ayrıştırılmasını sağlar. Protein çözeltisi ilk önce pH gradyanı olan bir kolonda izoelektrik noktalarına göre ayrıştırılır. Ardından bu kolon 90° çevrilerek SDS-PAGE (sodyum dodesil sülfat-poliakrilamid jel elektroforezi) denilen bir boyuta göre ayrıştırma yöntemi ile moleküler ağırlıklarına göre ayrıştırılır.

Yüksek Basınçlı Sıvı Kromatografisi (HPLC)

Yüksek basınçlı sıvı kromatografisi sayesinde kısa sürede bileşenlerin yapısal ve fonksiyonel analizlerini yapmak ve bu maddeleri saflaştırmak mümkündür. Bu teknik amino asitlerin, karbonhidratların, lipidlerin, nükleik asitlerin, proteinlerin ve steroidlerin ayrıştırılmasında ve tanımlanmasında mükemmel sonuçlar verir. Yüksek basınçlı sıvı kromatografisinde hareketli faz, 10-400 atm basınç altında ve 0,1-5 cm/s bir akış hızı ile çok ince olan kolonlardan geçer. Bu teknikte küçük partiküllerin kullanılması ve solvente yüksek basınç uygulanması HPLC’nin ayrıştırma gücünü artırır ve analizin kısa sürede tamamlanması sağlanır. Bir HPLC cihazının temel parçaları solvent deposu, yüksek basınç sağlayan bir pompa, kolon, ayrıştırılan numuneyi tespit eden detektörler ve kaydedicilerdir. Bilgisayar sistemleri ile ayrıştırma süresi kontrol edilir ve numune incelenir.

Sonuç

Kromatografi ilk icat edildiği zamanlarda, bitkisel pigmentler gibi bileşenleri renklerine göre ayırmak için kullanılıyordu. Zamanla kromatografi yöntemlerinin sayısı arttı ve uygulama alanları oldukça genişletildi. Günümüzde kromatografi yüksek derecede hassas ve etkili bir saflaştırma ve ayrıştırma yöntemi olarak kabul edilmektedir. Kolon kromatografisi, diğer kromatografi teknikleri için bir temel oluşturur ve uygulaması basit bir yöntemdir. Kromatografik yöntemlerle proteinlerin saflığı kontrol edilebilir.

Oldukça gelişmiş bir teknik olan HPLC ile proteinler moleküler ağırlıklarına göre çok detaylı bir şekilde saflaştırılabilir. Bunun yanında amino asitler, nükleik asitler, hidrokarbonlar, karbonhidratlar, ilaçlar, antibiyotik ler ve steroidler, saflaştırılmak istenen numunenin özellikleri doğrultusunda seçilen kromatografik yöntemlerle çalışmak mümkündür.